对于女性而言，性激素六项检查的最佳时间通常是在月经来潮后的第2天到第5天之间，特别是第2天或第3天。这一时间段内，女性体内的激素水平相对稳定，且卵泡处于初始发育期，因此检查结果能够较为准确地反映卵巢的基础功能。检查前需要空腹，以避免食物对检测结果的影响。
但对于绝经、月经长期不来潮而且又急于了解检查结果者，则随时可以检查，这个时间就默认为月经前的时间，其结果也就参照黄体期的检查结果。
对于男性而言，性激素六项检查的时间相对灵活，并没有固定的最佳时间。不过，为了保证检查结果的准确性，建议男性在早晨空腹状态下进行检查。此外，男性在检查前一天应避免食用过于油腻、高蛋白的食物，并避免熬夜和剧烈运动。